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哺乳動(dòng)物蛋白抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)

Mammalian Protein Extraction Kit

貨號(hào)： K0889   

保存：蛋白酶抑制劑混合物：-20℃

   其它 組分：室溫   

組分說(shuō)明

Catalog no.                     K0889      K0889A

Kit Size                       25  次      100  次

Mammalian Protein Extraction Reagent     25 ml        100 ml

蛋白酶抑制劑混合物                 250  μl       1 ml

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

      哺乳動(dòng)物蛋白抽提試劑能夠快速，溫和，高效的裂解哺乳動(dòng)物細(xì)胞，有效提取細(xì)胞漿和細(xì)胞核蛋白。該試劑使用溫和配方保證所提取蛋白保持生物學(xué)活性并可應(yīng)用于多種蛋白分析試驗(yàn)，如：報(bào)告基因和酶活性測(cè)定，免疫檢測(cè)，蛋白純化等。提取后蛋白可采用          BCA  法進(jìn)行蛋白定量分析。哺乳動(dòng)物蛋白抽提試劑盒中帶有蛋白酶抑制劑混合物，可有效避免蛋白提取過(guò)程中蛋白的降解。

注意事項(xiàng)

 1. 本產(chǎn)品可有效裂解細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞（無(wú)需刮?。┮约半x心收集的懸浮細(xì)胞，較反復(fù)凍融或超聲法具有更高提取效率。但對(duì)于組織蛋白的抽提，建議使用組織蛋白抽提試劑（#K0004，#K0891）。

 2. 表一中所列的是貼壁細(xì)胞蛋白提取的J使用量，如果需要減少試劑用量從而獲得更高的蛋白濃度，建議首先刮取細(xì)胞。

 3. 對(duì)于離心獲得的細(xì)胞，如果丌知道細(xì)胞的體積，可以根據(jù)細(xì)胞數(shù)量估計(jì)抽提試劑的使用量。如2×10⁶個(gè)Hela 細(xì)胞約重20 mg，需要加入200μl 抽提試劑，以此類(lèi)推。

 4. 通過(guò)本產(chǎn)品提取的蛋白，可通過(guò)BCA法進(jìn)行蛋白定量分析。

操作步驟        

 ●  貼壁細(xì)胞蛋白抽提

 1.  小心傾去貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)液。

 2.  注意：如培養(yǎng)基中含有酚紅或其他可能影響試驗(yàn)結(jié)果的物質(zhì)，請(qǐng)先使用PBS漂洗細(xì)胞。

 3.  請(qǐng)?jiān)诘鞍壮樘崆叭〕鰧?shí)驗(yàn)所需蛋白抽提試劑進(jìn)行預(yù)冷， 按照1:99比例加入蛋白酶抑制劑混合物（例如990μl抽提試劑中加入10μl蛋白酶抑制劑混合物），使蛋白酶抑制劑混合物在抽提試劑中成1×工作液。

注意：在進(jìn)行蛋白抽提前2-3分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑混合物。

 4.  加入適量哺乳動(dòng)物蛋白抽提試劑，（在冰上用槍頭吹打貼壁細(xì)胞，將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中），冰上孵育20分鐘，讓細(xì)胞充分裂解（試劑使用量請(qǐng)參考附表1，冰上放置時(shí)間應(yīng)根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型丌同進(jìn)行調(diào)整）。

 5.  14,000×g離心5-10分鐘。

 6.  轉(zhuǎn)移上清液至新管中，用于進(jìn)一步分析。

 ●  懸浮細(xì)胞蛋白提取

 1. 將懸浮細(xì)胞2,500×g，離心10分鐘，棄去上清。

 2. 可選步驟：漂洗。如培養(yǎng)基中含有酚紅或其他可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的物質(zhì)，請(qǐng)使用PBS漂洗細(xì)胞。

 3. 漂洗后的細(xì)胞懸浮液2,500×g，離心10min，棄去上清。

 4. 請(qǐng)?jiān)诘鞍壮樘崆叭〕鰧?shí)驗(yàn)所需蛋白抽提試劑進(jìn)行預(yù)冷，                             按照1:99比例加入蛋白酶抑制劑混合物（例如990μl抽提試劑中加入10μl蛋白酶抑制劑混合物），使蛋白酶抑制劑混合物在抽提試劑中成1×工作液。

注意：在進(jìn)行蛋白抽提前2-3分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑混合物。

 5. 加入適量哺乳動(dòng)物蛋白抽提試劑，每100 mg (~100 µl)細(xì)胞至少加入1 ml哺乳動(dòng)物蛋白抽提試劑。如提取的樣本量較大，可首先使用抽提試劑總使用量的1/10重懸細(xì)胞沉淀，然后加入剩余抽提試劑。

 6. 吹打均勻后，冰上放置20分鐘，讓細(xì)胞充分裂解（冰上放置時(shí)間應(yīng)根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型丌同進(jìn)行調(diào)整）。                                                 

7. 14,000×g離心15分鐘。

8. 轉(zhuǎn)移上清至新管中，進(jìn)行下一步分析。

 注：每100 mg細(xì)胞約可提取到6 mg的總蛋白（細(xì)胞類(lèi)型丌同略有差異）。                      

參考附表

                                            表  1. 抽提試劑使用量推薦表

細(xì)胞培養(yǎng)板類(lèi)型或平皿類(lèi)型                     抽提試劑使用量

100 mm                         500-1,000 µl

60 mm                           250-500 µl

6 孔培養(yǎng)板                         200-400 µl /孔

24 孔培養(yǎng)板                         100-200 µl /孔

96 孔培養(yǎng)板                          50-100 µl/孔

* 對(duì)于  100 mm  培養(yǎng)板培養(yǎng)的10⁷個(gè)細(xì)胞  (50 mg)可裂解獲得約3 mg 總蛋白（細(xì)胞類(lèi)型不同略有差異）。            

 2. 常見(jiàn)問(wèn)題及解決辦法

 1. 低提取率

可能原因：

a低蛋白表達(dá)量

b試劑使用量不夠

c試劑無(wú)法溶解細(xì)胞膜

解決方法：

a優(yōu)化轉(zhuǎn)染系統(tǒng)

b增加抽提試劑使用量

c增加裂解時(shí)間或者加大晃動(dòng)幅度

2. 無(wú)法獲得膜蛋白  

可能原因：用哺乳動(dòng)物蛋白抽提試劑提取核/漿蛋白  

解決方法：使用真核細(xì)胞膜蛋白抽提試劑盒                                                                                                               

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